Белковая инженерия для сердечно-сосудистой терапии: неиспользованный потенциал восстановления сердца

Рейтинг: 4.6 из 5
Автор
Вадим Соколов
Рейтинг автора
4.6

В настоящее время исследуются многочисленные новые и инновационные подходы к восстановлению поврежденного миокарда, которые дали несколько обнадеживающих результатов. В дополнение к прогрессу подходов, основанных на стволовых клетках, и методов генной терапии / сайленсинга, продолжают появляться доказательства того, что белковые терапевтические средства могут использоваться для непосредственного стимулирования восстановления сердца и даже регенерации. Однако терапевтический потенциал белков часто ограничен коротким локальным периодом полураспада и недостаточной биодоступностью и / или биоактивностью, и многие академические лаборатории, изучающие сердечно-сосудистые заболевания, более уверенно относятся к молекулярной и клеточной биологии, чем к биохимии белков.Белковая инженерия широко используется для преодоления недостатков, традиционно связанных с белковыми терапевтическими средствами, и имеет потенциал для специфического повышения эффективности молекул для восстановления сердца. Тем не менее, белковая инженерия как стратегия еще не использовалась при разработке сердечно-сосудистых терапевтических средств в той степени, в какой она применяется в других областях. В этом обзоре мы обсуждаем роль модифицированных белков в сердечно-сосудистой терапии на сегодняшний день. Кроме того, мы обращаем внимание на перспективу применения новейших технологий белковой инженерии в сердечно-сосудистой медицине и на препятствия, которые необходимо преодолеть, чтобы обеспечить максимальный успех этого подхода.мы обсуждаем роль искусственно созданных белков в сердечно-сосудистой терапии на сегодняшний день. Кроме того, мы обращаем внимание на перспективу применения новейших технологий белковой инженерии в сердечно-сосудистой медицине и на препятствия, которые необходимо преодолеть, чтобы добиться максимального успеха этого подхода.мы обсуждаем роль искусственно созданных белков в сердечно-сосудистой терапии на сегодняшний день. Кроме того, мы обращаем внимание на перспективу применения новейших технологий белковой инженерии в сердечно-сосудистой медицине и на препятствия, которые необходимо преодолеть, чтобы обеспечить максимальный успех этого подхода.

В последнее время произошел взрыв интереса к новым методам лечения сердца. В частности, большое внимание привлекли клинические испытания клеточной сердечно-сосудистой терапии, и предварительные результаты кажутся обнадеживающими 1, 2. Однако механизм действия клеточной терапии остается неясным, и многие детали, касающиеся характеристики, контроля качества и доставки клеток, еще предстоит проработать до широкого терапевтического применения. Тем не менее, сообщения об эффективности терапии на основе сердечных клеток в испытаниях на людях вызвали интерес к дополнительным терапевтическим путям развития. Действительно,Идентификация высвобождения паракринных белков как одного из механизмов, с помощью которого клеточная терапия в сердце может улучшать сердечную функцию 3, стимулировала возобновление интереса к терапевтическим подходам на основе белков для восстановления сердца.

Хотя белковая терапия становится все более популярной во многих областях, включая рак и воспалительные заболевания - 9 из 20 самых продаваемых лекарств в 2012 году были белками 4 - белки имеют относительно низкое проникновение на рынок сердечно-сосудистых заболеваний. Это не означает отсутствие прогресса в развитии сердечно-сосудистой терапии, поскольку низкомолекулярные препараты, такие как статины 5, 6 и антикоагулянты 7, добились огромных успехов. Скорее, поскольку в целом новые лекарственные препараты смещаются в основном на белки, разработка белковой терапии представляет собой область возможностей для сердечно-сосудистой медицины. Белковая терапия позволяет проводить более целенаправленные вмешательства - с четко определенными регуляторными путями, улучшенной масштабируемостью и потенциально сниженной общей стоимостью - по сравнению с подходами на основе клеток. Более того,Белки имеют гораздо большую площадь поверхности, чем небольшие молекулы типичных пероральных биодоступных лекарств, и, таким образом, многие из молекулярных мишеней, которые, вероятно, не «поддаются лекарству» с помощью малых молекул, могут быть поражены белками. Классическим примером этой концепции является то, что никакая клинически успешная малая молекула не активирует рецептор инсулина, и поэтому пациенты с диабетом I типа должны вводить инсулин.

Что касается белков для сердечно-сосудистой терапии, много усилий было направлено на улучшение формирования микрососудов сердца. Совсем недавно была выявлена ​​способность белков вызывать пролиферацию кардиомиоцитов 8, что усиливает оптимизм в отношении того, что подходы на основе белков могут быть эффективными для регенерации сердца. Однако белковые терапевтические препараты часто имеют ограничения, включая низкую биодоступность, нежелательные фармакокинетические характеристики и профили биораспределения, а также эффекты, не соответствующие цели 9–12. Одним из подходов к преодолению этих недостатков является белковая инженерия, стратегия, которая может не только сделать терапевтическую концепцию осуществимой, но и создать интеллектуальную собственность, необходимую для развития у пациентов.

Термин «белковая инженерия» является общим, который охватывает многие методы модификации белков, включая использование технологий молекулярного дисплея для обеспечения целевой доставки 13, 14, структурную модификацию белков для придания улучшенных свойств, таких как устойчивость к ферментативной деградации за счет рационального дизайна. 15 или направленная эволюция 16, слияние белков с полимерами или другими белковыми доменами для содействия уклонению от иммунитета 17, 18, включение желаемых свойств или функциональных групп через неканонические аминокислоты 19, 20 и многие другие. Несмотря на это обещание и широкое применение в таких областях, как онкология, инженерные белковые терапевтические средства до сих пор не смогли стать основной частью инструментария кардиолога. Здесь мы рассмотрим использование белковых терапевтических подходов в сердце на сегодняшний день.с упором на методы лечения, которые достигли стадии клинических испытаний. Затем мы выделяем новые и многообещающие методы белковой инженерии и обсуждаем, как в сочетании с новыми открытиями в молекулярной кардиологии эти подходы могут привести к новому поколению терапевтических средств для восстановления сердца.

Белковая инженерия для сердечно-сосудистой терапии на сегодняшний день

Хотя ни один из них еще не получил широкого клинического применения, многочисленные инженерные белки были применены для лечения сердечно-сосудистых заболеваний в клинических испытаниях. Многие другие терапевтические подходы с использованием нативных белков также применялись для восстановления сердца, и некоторые из них могут получить пользу от белковой инженерии. Некоторые из самых ранних и наиболее заметных примеров технологии белковой инженерии для сердечно-сосудистой терапии были клиническими неудачами. Однако другие примеры оказались более успешными, и продолжающиеся клинические испытания открывают захватывающие возможности.

Антагонисты фактора некроза опухоли (TNF)

Один из наиболее ярких и в конечном итоге неудачных примеров трансляции технологии белковой инженерии для сердечно-сосудистой терапии касался антагониста TNF этанерцепта (Enbrel®). Этанерцепт, разработанный на основе исследования Бейтлера и его коллег 21, представляет собой димерный слитый белок, включающий Fc-область человеческого иммуноглобулина G1 и домен растворимого человеческого рецептора 2 TNFR2 (TNFR2), который одобрен для лечения различных форм артрита. После описания сверхэкспрессии TNF при сердечной недостаточности 22 была выдвинута гипотеза, что ингибирование TNF может быть эффективным методом лечения. Однако, несмотря на первоначальные многообещающие результаты в тщательно проведенных исследованиях, как доклинически 23, 24, так и у пациентов 25, 26,Два крупномасштабных клинических исследования показали, что этанерцепт не только не показал клинической пользы у пациентов с хронической сердечной недостаточностью (ХСН), но и на самом деле может повысить риск заболеваемости и смертности, связанных с ХСН 27. Более того, химерное моноклональное антитело инфликсимаб (Remicade®), ингибитор TNF, который работает по другому механизму, чем этанерцепт 28, 29, также не улучшил клинический исход у пациентов с сердечной недостаточностью, при этом высокие дозы показали серьезные побочные эффекты 30. Следует отметить, что и этанерцепт, и инфликсимаб эффективны против различных форм артрита, а инфликсимаб очень эффективен против болезни Крона.Таким образом, антагонизм TNF на основе белковой инженерии оказался примером успешного пути разработки продукта, который до сих пор безуспешно применялся в сердечно-сосудистой терапии, несмотря на убедительные доклинические исследования.

Натрийуретические пептиды

Натрийуретические пептиды представляют собой пример многообещающего применения белковой инженерии в сердечно-сосудистой терапии. Предсердный натрийуретический пептид (ANP) и натрийуретический пептид B-типа (BNP), также известный как мозговой натрийуретический пептид и базовый натрийуретический пептид, обладают сходной активностью и хорошо зарекомендовали себя как полезные биомаркеры при сердечно-сосудистой терапии 31, 32. Кроме того, было показано, что экзогенное введение BNP улучшает множество параметров у пациентов с систолической сердечной недостаточностью 33. Однако использование BNP в качестве терапевтического (несритида) может быть ограничено из-за его гипотензивных эффектов 34. Натрийуретический белок C-типа (CNP) вызывает более низкий гипотензивный ответ, чем ANP и BNP, из-за его недостаточной активности в артериях из-за дифференциальной экспрессии рецепторов 35. Кроме того, родственный пептид, выделенный из змеиного яда,Dendroaspis Natriuretic Peptide (DNP), действует аналогично ANP и BNP, но очень эффективен и устойчив к ферментативной деградации 36. Чтобы усилить полезные свойства CNP и DNP, Burnett и др. Синтезировали химерный натрийуретический пептид, который включает домены обоих (CD-NP) 37. Первоначальные результаты клинических испытаний этого сконструированного белка в качестве терапии сердечной недостаточности были многообещающими 38, а последующее исследование может пролить больше света на потенциал CD-NP для клинического использования 39.

Инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1)

IGF-1 представляет собой белок с молекулярной структурой, подобной инсулину, который, как было показано, обеспечивает защиту от прогрессирования сердечной недостаточности у мышей 40. У людей низкие уровни IGF-1 в сыворотке связаны с повышенным риском ишемической болезни сердца 41. Однако нежелательные побочные эффекты системной доставки IGF-1 хорошо известны и включают повышенный риск диабетической ретинопатии и рака 42–44. Таким образом, на начало 2013 года было только два активных клинических испытания IGF-1 (Mecasermin®) в качестве сердечно-сосудистой терапии 45, 46. В попытке преодолеть эти эффекты путем продвижения местной доставки Tokunou et. al. сконструировали слияние IGF-1 с гепарин-связывающим (HB) доменом гепарин-связывающего эпидермального фактора роста, чтобы сделать HB-IGF, который оказался эффективным в стимулировании биосинтеза хондроцитов 47. Кроме того,Hubbell и его коллеги разработали вариант IGF-1 с повышенной способностью к иммобилизации в фибрине, который улучшил пролиферацию гладкомышечных клеток 48, представив возможность ко-факториальной локальной доставки. Примечательно, что IGF-1, модифицированный для обеспечения взаимодействия с самособирающимися пептидами для доставки в сердце, продемонстрировал эффективность в улучшении сердечной функции после MI 49,50. Таким образом, хотя еще не применяемые в клинических испытаниях, сконструированные варианты IGF-1 могут дать терапевтические средства для сердечно-сосудистой терапии.IGF-1, модифицированный для обеспечения взаимодействия с самособирающимися пептидами для доставки в сердце, продемонстрировал эффективность в улучшении сердечной функции после MI 49,50. Таким образом, хотя еще не применяемые в клинических испытаниях, сконструированные варианты IGF-1 могут дать терапевтические средства для сердечно-сосудистой терапии.IGF-1, модифицированный для обеспечения взаимодействия с самособирающимися пептидами для доставки в сердце, продемонстрировал эффективность в улучшении сердечной функции после MI 49,50. Таким образом, модифицированные варианты IGF-1, хотя еще не применяемые в клинических испытаниях, могут дать терапевтические средства для сердечно-сосудистой терапии.

Фактор-1α, полученный из стромальных клеток (SDF-1)

Один из белков, который проходит активные клинические исследования для регенерации сердца - хотя в настоящее время не используется в качестве белковой терапии - это SDF-1. SDF-1 является хемокином, который играет важную роль в ангиогенезе и переносе лейкоцитов 51. Открытие того, что SDF-1 индуцирует возвращение стволовых клеток в сердце после повреждения 52, 53, вызвало интерес к его терапевтическому применению. Однако SDF-1 протеолитически расщепляется как матриксной металлопротеиназой-2 (ММР-2) 54, 55, так и дипептидилпептидазой IV 56, и, таким образом, вероятность сохранения биологической активности миокарда после повреждения - сильно воспалительной среды - мала. По этой и другим причинам единственное активное клиническое испытание SDF-1 для сердечной терапии использует доставку плазмиды 57, 58,который предлагает потенциал для пролонгированной экспрессии SDF-1, но также ограничен проблемами безопасности и непредсказуемости, характерными для подходов к генной терапии. Белковая инженерия применительно к SDF-1 предлагает альтернативу; мы разработали устойчивую к протеазе форму SDF-1 путем мутации одной аминокислоты в сайте расщепления MMP-2 15. Этот устойчивый к протеазе SDF-1 успешно индуцировал рекрутирование эндотелиальных клеток-предшественников в сердце после MI, что приводило к улучшению сердечной функции 15 и приводило к усилению ангиогенеза и улучшенной функции желудочков после начала ишемии миокарда 59. Также сообщалось о попытках белковой инженерии улучшить доставку и удержание SDF-1 в тканях 60, как и создание полипептидного аналога SDF-1, который индуцировал улучшенное восстановление после MI по сравнению с нативным белком 61.В будущем синергия этих и других стратегий белковой инженерии может позволить разработать терапевтический подход, который преодолеет ограничения нативного белка SDF-1.

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF)

G-CSF представляет собой гликопротеин, который избирательно индуцирует снижение SDF-1 и увеличение рецептора SDF-1 CXCR4 в костном мозге 62. Большинство клинических испытаний с участием G-CSF в сердце было сосредоточено на его использовании в качестве дополнения к клеточной терапии 63–65, но другие оценивали его потенциал в качестве первичной терапии 66–69, поскольку было показано, что G-CSF предотвращает вредные воздействия. ремоделирование после МИ 70. Потенциальный следующий шаг в этих активных направлениях терапевтических исследований может включать использование слитых белков, включающих части G-CSF, поскольку уже сообщалось об улучшенной функциональности, связанной с доставкой 71 и стабильностью 72 G-CSF.

Антагонисты рецепторов интерлейкина (ИЛ)

Интерлейкины - это белки, которые вызывают плейотропные эффекты в большом количестве типов клеток 73. В сердце IL-1 является мощным медиатором воспаления во время ишемии / реперфузии 74, а повышенные уровни IL-6 в плазме связаны с повышенным риском будущего MI 75, поэтому их ингибирование представляет терапевтический интерес. У IL-1 есть естественный конкурентный ингибитор своего рецептора (IL-1R), антагонист рецептора IL-1 белка, родственного IL-1 (IL-1Ra), также известный как анакинра 76. Как принудительная сверхэкспрессия, так и инъекции anakinra, как было показано, снижают апоптоз после повреждения сердца у грызунов 74, 76, и этот препарат применялся в клинических испытаниях с многообещающими результатами 77. Кроме того, ингибирование IL-6 преследовалось посредством антагонизма его рецептора (IL-6R или CD126) с помощью сконструированного гуманизированного моноклонального антитела,тоцилизумаб. Обнадеживает тот факт, что сообщение о случае применения тоцилизумаба на людях привело к успешному улучшению сердечной дисфункции, связанной с мультицентрической болезнью Кастлемана, было опубликовано 78, а клинические испытания, изучающие эффективность тоцилизумаба при инфаркте миокарда, продолжаются 79. Таким образом, антагонисты рецепторов интерлейкина могут представлять собой многообещающий путь вперед в области белковой инженерии, применяемой в сердечно-сосудистой терапии.

Эритропоэтин (ЭПО)

Гликопротеин, который регулирует выработку красных кровяных телец, EPO обладает хорошо задокументированными кардиозащитными свойствами и работает через несколько механизмов 80, 81. Доклинические исследования на моделях острого инфаркта миокарда у крыс 82 и кроликов 83 показали, что введение ЭПО улучшает сократительную способность сердца и параметры гемодинамики, что побудило людей провести клинические испытания. Первоначальные результаты показали, что EPO, хотя и не может улучшить фракцию выброса левого желудочка, может уменьшить сердечную недостаточность у пациентов с острым инфарктом миокарда 84. Однако более недавнее исследование поставило под сомнение потенциал ЭПО в качестве терапии сердечной недостаточности, указав, что это может привести к увеличению размера инфаркта 85. Благодаря этим результатам акцент сместился на изучение эффективности низких доз ЭПО 86,подход, которому может помочь применение техник белковой инженерии для улучшения активности и стабильности EPO, как уже было продемонстрировано 87.

Нейрегулин-1β (NRG)

NRG является важным регулятором сердечно-сосудистого развития и играет важную роль в сердечно-сосудистых заболеваниях 88. Кардиозащитный потенциал NRG был хорошо установлен в доклинических моделях 89, 90, и энтузиазм по поводу будущего терапевтического применения NRG при сердечной недостаточности увеличился после сообщения о его потенциальной способности индуцировать пролиферацию кардиомиоцитов 8. Клинические испытания с доменом NRG, подобным эпидермальному фактору роста (EGF), при сердечной недостаточности продемонстрировали безопасность и эффективность 91, 92, а другая молекула NRG - глиальный фактор роста-2 (GGF-2) в настоящее время проходит клинические испытания для сердца. отказ 93 и продемонстрировал эффективность на доклинической модели 94. Природа взаимодействий между родственным рецептором NRG в сердце, ErbB4, и его предпочтительным партнером по индукции сигнала, ErbB2,может предоставить возможность использования с помощью белковой инженерии. Наша группа предположила, что взаимодействия рецепторов ErbB, которые являются предпосылкой для передачи сигналов, могут быть отклонены от наиболее часто индуцируемых партнерств за счет аффинных взаимодействий рецептор-лиганд, налагаемых двухвалентным лигандом ErbB 95. Бивалентный NRG (NN), как было показано, индуцирует дифференциальную передачу сигналов по сравнению с NRG 95 и обладает превосходной кардиозащитной эффективностью по сравнению с EGF-подобным доменом NRG на мышиной модели вызываемой доксорубицином кардиомиопатии 96. Дальнейшее изучение этой стратегии может выявить преимущества белковой инженерии для NRG в восстановлении и регенерации сердца.д. быть отклоненными от наиболее часто индуцируемых партнерств за счет аффинных взаимодействий рецептор-лиганд, налагаемых бивалентным лигандом ErbB 95. Бивалентный NRG (NN), как было показано, индуцирует дифференциальную передачу сигналов по сравнению с NRG 95 и обладает превосходной кардиозащитной эффективностью по сравнению с EGF-подобным доменом NRG на мышиной модели вызываемой доксорубицином кардиомиопатии 96. Дальнейшее изучение этой стратегии может выявить преимущества белковой инженерии для NRG в восстановлении и регенерации сердца.д. быть отклоненными от наиболее часто индуцируемых партнерств за счет аффинных взаимодействий рецептор-лиганд, налагаемых бивалентным лигандом ErbB 95. Бивалентный NRG (NN), как было показано, индуцирует дифференциальную передачу сигналов по сравнению с NRG 95 и обладает превосходной кардиозащитной эффективностью по сравнению с EGF-подобным доменом NRG на мышиной модели вызываемой доксорубицином кардиомиопатии 96. Дальнейшее изучение этой стратегии может выявить преимущества белковой инженерии для NRG в восстановлении и регенерации сердца.Дальнейшее изучение этой стратегии может выявить преимущества белковой инженерии для NRG в восстановлении и регенерации сердца.Дальнейшее изучение этой стратегии может выявить преимущества белковой инженерии для NRG в восстановлении и регенерации сердца.

Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактор роста фибробластов (FGF)

В связи с их хорошо изученным митогенным действием на эндотелиальные клетки во многих контекстах, VEGF 97 и FGF 98, а также их сплайсинговые изоформы и варианты, в последнее время тщательно изучались на предмет терапевтической васкуляризации сердца.

25 лет 99–101. Однако отрицательные результаты ранних клинических испытаний как с FGF 102, так и с VEGF 103 остановили прогресс в направлении клинического воплощения подходов к терапевтической васкуляризации с общими ограничениями, такими как короткий период полураспада и системные побочные эффекты, названные в качестве причин неудач. Доклинические исследования белковой инженерии улучшенной стабильности ангиогенных факторов роста с помощью разнообразных методик многочисленны 104-110, и сообщается о потенциале локальной доставки VEGF посредством слияния с коллаген-связывающим доменом 111. Однако до сих пор не существует белковых препаратов для терапевтической васкуляризации сердца, используемых в клинической практике. Стратегии, сочетающие белковую инженерию с нанотехнологиями 109 или другими методами для улучшения доставки 49,112–115 могут дать надежду на то, что в будущем появятся возможности лечения на основе белков для терапевтической васкуляризации сердца.

Дополнительные терапевтические возможности

Помимо того, что упомянуто выше, дополнительные текущие сердечно-сосудистые терапевтические усилия могут выиграть от белковой инженерии. Также сообщалось, что периостин, как и NRG, индуцирует пролиферацию кардиомиоцитов 116 и, таким образом, может представлять дополнительный терапевтический интерес. Фактор дифференциации роста 11 (GDF11) недавно был идентифицирован как посредник обращения вспять возрастной гипертрофии сердца 117 и может открыть новую область исследований белковой терапии для сердца и других органов. Терапия на основе глюкагоноподобного пептида-1 была эффективна доклинически 118, а применяемый в настоящее время циклический пептидный подход 119 может быть усовершенствован с помощью белковой инженерии.Смещенные лиганды рецепторов, связанных с G белками, открывают интригующие перспективы 120 и представляют собой матрицу для будущих стратегий белковой инженерии, разработанных для содействия селективной активации рецепторов, таких как уже было сделано для системы рецепторов ErbB 95. Адипокины - это пептиды или белки, секретируемые адипоцитами, которые могут оказывать положительное или отрицательное воздействие на сердечно-сосудистую систему в зависимости от того, когда и как долго они подвергаются его воздействию (см. Обзоры в 121, 122). Технологии белковой инженерии, которые обеспечивают усиленный контроль над локализацией в тканях и доставкой этого класса пептидов / белков, могут оказаться критическими для их возможного терапевтического применения. Кроме того, внутривенное введение иммуноглобулинов может быть эффективным при определенных формах сердечной недостаточности 123.Инженерия белков, возможно, наиболее широко применялась к молекулам иммуноглобулинов, и поэтому любые эффекты, наблюдаемые в текущих клинических испытаниях 124, потенциально могут быть усилены с помощью надежных подходов к инженерии белков. Терапевтические подходы на основе антител, а также другие белковые терапии для иммуномодуляции продолжают появляться как потенциальные методы лечения атеросклероза 125. Совсем недавно были разработаны миметические пептиды и моноклональные антитела для ингибирования PCSK9 с целью снижения уровней холестерина 126. Все вышеупомянутые подходы являются многообещающими, и дальнейшее применение методов белковой инженерии для улучшения этих терапевтических стратегий потенциально может повысить их эффективность.и поэтому любые эффекты, наблюдаемые в продолжающихся клинических испытаниях 124, потенциально могут быть усилены с помощью надежных подходов к инженерии белков. Терапевтические подходы на основе антител, а также другие белковые терапии для иммуномодуляции продолжают появляться как потенциальные методы лечения атеросклероза 125. Совсем недавно были разработаны миметические пептиды и моноклональные антитела для ингибирования PCSK9 с целью снижения уровней холестерина 126. Все вышеупомянутые подходы являются многообещающими, и дальнейшее применение методов белковой инженерии для улучшения этих терапевтических стратегий потенциально может повысить их эффективность.и поэтому любые эффекты, наблюдаемые в продолжающихся клинических испытаниях 124, потенциально могут быть усилены с помощью надежных подходов к инженерии белков. Терапевтические подходы на основе антител, а также другие белковые терапии для иммуномодуляции продолжают появляться как потенциальные методы лечения атеросклероза 125. Совсем недавно были разработаны миметические пептиды и моноклональные антитела для ингибирования PCSK9 с целью снижения уровней холестерина 126. Все вышеупомянутые подходы являются многообещающими, и дальнейшее применение методов белковой инженерии для улучшения этих терапевтических стратегий потенциально может повысить их эффективность.миметические пептиды и моноклональные антитела были разработаны для ингибирования PCSK9 для снижения уровней холестерина 126. Все вышеупомянутые подходы являются многообещающими, и дальнейшее применение методов белковой инженерии для улучшения этих терапевтических стратегий потенциально может повысить их эффективность.миметические пептиды и моноклональные антитела были разработаны для ингибирования PCSK9 с целью снижения уровней холестерина 126. Все вышеупомянутые подходы являются многообещающими, и дальнейшее применение методов белковой инженерии для улучшения этих терапевтических стратегий потенциально может повысить их эффективность.

Терапевтические рубежи в протеиновой инженерии

Несмотря на внедрение некоторых белковых терапевтических средств для сердечно-сосудистой терапии, многие ограничения все еще остаются. Возможность направленной доставки белка или любого лекарственного средства непосредственно в сердце минимизирует требуемую дозу, а также нежелательные эффекты, не соответствующие цели; но эта способность остается в основном за пределами нашей нынешней досягаемости. В целом, белки часто рассматриваются как плохие кандидаты в лекарства из-за низкой биодоступности при пероральном приеме, отсутствия долгосрочной стабильности и других характеристик, и это также относится к белкам для сердечно-сосудистой терапии. В самом деле, друг авторов - химик-органик, который в настоящее время работает в области открытия лекарств в крупной фармацевтической компании, - обнаружил, что многих профессионалов в области открытия лекарств с химическим образованием учат общей мантре: «белки - это не лекарства».Революция в биотехнологии помогла изменить это восприятие, и белковая инженерия является важной причиной этого, поскольку такие области, как онкология, переполнены новыми инженерно-техническими терапевтическими белками. Однако эта революция по большей части произошла за пределами сердечно-сосудистой медицины. Существующие сердечно-сосудистые терапевтические средства, созданные с помощью белковой инженерии, упомянутые выше, демонстрируют только часть потенциала этой области. В настоящее время разрабатываются инновационные и захватывающие подходы к белковой инженерии, многие из которых уже применяются в терапии, не связанной с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Применение этих быстроразвивающихся технологий в сердечно-сосудистой медицине - например, для обеспечения адресной доставки лекарств, специфичных для сердца, для повышения стабильности белка и времени циркуляции,или стимулировать прямую стимуляцию определенных путей для стимулирования кардиомиогенеза с помощью терапевтического белка - может повысить эффективность кардиотерапии на основе белков.

Молекулярный дисплей

Молекулярный дисплей включает в себя методы, которые представляют молекулы - обычно пептиды или белки - на поверхности клетки, вируса или другого объекта-хозяина. Этот подход позволяет связать генотип и фенотип отображаемой молекулы, поскольку ее кодирующая информация гибридизируется с информацией о носителе. Таким образом, селективное обогащение возможно за счет последовательных этапов размножения в определенных условиях - процесса, известного как пэннинг - и большие библиотеки полипептидов могут быть проверены на предмет желаемых свойств или взаимодействий (рис. 1).

Молекулярный дисплей. Белок или пептид со специфическими свойствами можно получить с помощью молекулярного дисплея после нескольких раундов отбора. Библиотеки полипептидов могут быть изготовлены или приобретены и либо вставлены в молекулярных хозяев, таких как фаг или дрожжи, либо присоединены к молекулам-носителям, таким как мРНК или рибосомы. Схема выше представляет фаг или дисплей на поверхности клетки, где белки отображаются на поверхностях организмов, которые впоследствии подвергаются воздействию различных субстратов, которые служат критериями отбора. В приведенном выше примере опосредованное белком связывание организма со специфическим субстратом с последующим вымыванием неспецифических связывающих веществ и элюированием позволяет амплифицировать те организмы, которые демонстрируют белки с желаемыми свойствами.Повторный скрининг с дополнительными или более строгими критериями отбора позволяет в конечном итоге выделить оптимизированную последовательность белка на основе фенотипа, которая затем может быть связана с генотипом после извлечения генетического материала из организма. Таким образом, молекулярный дисплей облегчает обнаружение информации, необходимой для создания белка со специфическими свойствами, которые эволюционировали, чтобы соответствовать практически любым выбранным критериям отбора.

Концепция молекулярного дисплея возникла после основополагающего отчета Джорджа Смита о фаговом дисплее, отображении чужеродного белка на поверхности нитчатого фага 13. С тех пор были разработаны многочисленные платформенные подходы к молекулярному дисплею, позволяющие проводить высокопроизводительный скрининг белковых взаимодействий. Такие технологии, как отображение на клеточной поверхности, отображение рибосом, отображение мРНК и другие, позволили направить эволюцию белков для улучшения активности и стабильности. Фаговый дисплей является наиболее часто используемым и популярным в биотехнологической промышленности, поскольку был использован при разработке многочисленных белковых лекарств 127, особенно антител 128. Помимо направленной эволюции,фаговый дисплей использовался для пэннинга биологических и / или тканевых образцов - известного как биопэннинг - для отбора пептидных лигандов, которые обеспечивают тканеспецифический хоминг 129 и / или улучшенное удерживание в тканях 130 лекарств или носителей лекарств.

Помимо фагового дисплея, появились другие технологии отображения, которые могут иметь значение для развития сердечно-сосудистой терапии в ближайшем будущем. Изобретенный Виттрупом и его коллегами 14 дисплей поверхности дрожжей позволяет, среди прочего, проводить высокопроизводительный количественный скрининг библиотек с помощью сортировки флуоресцентно-активируемых клеток (FACS) и был использован для создания антител 131 с чрезвычайно высокой аффинностью и пептидов 132, которые способствовали молекулярному нацеливанию, например, чтобы способствовать визуализации сосудов с высоким разрешением 133. Методы внеклеточной эволюции белков, такие как отображение 134 рибосом или отображение 135 мРНК, не обременены ограничениями трансформации или экспрессии, а также позволяют быстрое развитие связывающих белков с высоким сродством. Общий,Технологии молекулярного дисплея, как правило, представляют собой зрелые методы выбора и уточнения характеристик белков, которые имеют значительный потенциал для продвижения сердечно-сосудистой белковой терапии.

Инженерные белковые каркасы

На сегодняшний день антитела являются наиболее успешными белковыми терапевтическими средствами. Однако у антител есть слабые стороны в качестве терапевтических средств, включая ограниченное проникновение в ткани из-за их большого размера. Для решения этой и других проблем были разработаны многочисленные «инженерные белковые каркасы» (EPS). Для целей белковой инженерии EPS включает минимальный полипептидный каркас, который может быть основан либо на иммуноглобулиновой, либо на неиммуноглобулиновой молекуле 136. Каркас обычно является мономерным без дисульфидных связей или сайтов гликозилирования и обычно является очень стабильным и легко растворимым 137. EPS также обычно легко экспрессируются в организме-хозяине и имеют доступные на поверхности остатки, которые позволяют включать разнообразие последовательностей и последующий отбор посредством молекулярного дисплея.

Многочисленные ЭПС вышли из начальной стадии разработки и перешли к клиническому применению 137. К наиболее развитым относятся: аднектины 138, которые происходят из доменов фибронектина III типа; Anticalins 139, полученный из липокалина; Домены Кунитца 140, полученные из ингибиторов протеазы Кунитца; DARPins 141, полученные из белков анкириновых повторов; Авимеры 142, происходящие из А-домена рецептора липопротеинов низкой плотности; и многое другое. Экаллантид (Kalbitor®), рационально разработанный домен Куница, был одобрен в 2009 году для клинического использования для лечения наследственного ангионевротического отека 143 и потенциально может использоваться в кардиоторакальной хирургии в качестве замены апротинина. Многие другие ЭПС проходят испытания для бесчисленных применений 137, и поскольку молекулярные мишени для восстановления и регенерации сердца продолжают определяться,EPS может сыграть важную роль в будущем развитии сердечно-сосудистой терапии.

Неканонические аминокислоты (ncAAs)

Концепция включения неканонических аминокислот (также называемых неприродными аминокислотами, неприродными аминокислотами и искусственными аминокислотами) сайт-специфично в белки предлагает потрясающий потенциал: возможность присоединить любую интересующую химическую функциональную группу к белок, позволяющий связываться с другими белками или молекулами, такими как флуорофоры или низкомолекулярные препараты, с использованием простых, эффективных и настраиваемых химических реакций. Хотя существует несколько вариантов, общий подход включает аминоацилирование тРНК, которая имеет встроенный супрессорный антикодон с ncAA. Эта химическая модификация облегчает сайт-специфическое включение ncAA во время трансляции мРНК в сайт бессмысленного кодона,которые могут быть вставлены (сайт-специфично) в интересующий ген с использованием стандартных методов синтеза генов или молекулярной биологии 144 (рис. 2). Эта разработка технологии ncAA была впервые предложена Шульцем и его коллегами 19, и эта группа и многие другие внесли свой вклад в важные достижения, которые сделали ее надежной для придания белкам желаемой функциональности для терапевтического применения. Например, включение ncAA делает возможным сайт-специфическое ПЭГилирование терапевтических белков 145 для усиления уклонения от иммунной системы и увеличения времени циркуляции. Этот подход также позволяет вставлять молекулярные скобы - углеводородные линкеры, которые могут стабилизировать вторичную структуру белков частично за счет физического предотвращения энтропийной структурной релаксации - в белки для повышения стабильности 146.Эта стратегия может быть расширена с помощью методов лигирования экспрессированных белков 147 для слияния др. Сконструированных белков для аналогичных целей 148. Используя родственный процесс, разработанный Tirrell и др., Включение специфичных по остаткам ncAA, Interferonβ-1b был PEGylated для улучшения фармакологических свойств 149, 150. Сайт-специфическое включение ncAA было дополнительно использовано для создания биспецифических антител 151 и, таким образом, могло быть адаптировано для создания двухвалентных молекул NRG 95, которые могли бы стимулировать кардиомиогенез. Поскольку технология ncAA продолжает развиваться, ее потенциал для применения в сердечно-сосудистой терапии, что уже многообещающе, следует только увеличивать.Включение специфичного к остатку ncAA, интерферон β-1b был ПЭГилирован для улучшения фармакологических свойств 149, 150. Сайт-специфическое включение ncAA было дополнительно использовано для создания биспецифических антител 151 и, таким образом, могло быть адаптировано для создания двухвалентных молекул NRG 95, которые могли бы стимулировать кардиомиогенез. Поскольку технология ncAA продолжает развиваться, ее потенциал для применения в сердечно-сосудистой терапии, который уже многообещающий, должен только увеличиваться.Включение специфичного к остатку ncAA, интерферон β-1b был ПЭГилирован для улучшения фармакологических свойств 149, 150. Сайт-специфическое включение ncAA было дополнительно использовано для создания биспецифических антител 151 и, таким образом, могло быть адаптировано для создания двухвалентных молекул NRG 95, которые могли бы стимулировать кардиомиогенез. Поскольку технология ncAA продолжает развиваться, ее потенциал для применения в сердечно-сосудистой терапии, который уже многообещающий, должен только увеличиваться.его потенциал для применения в сердечно-сосудистой терапии, который уже является многообещающим, следует только усилить.его потенциал для применения в сердечно-сосудистой терапии, который уже является многообещающим, следует только усилить.

Включение неканонических аминокислот (ncAA) в белки. Включение ncAA в белки было показано несколькими методами. Приведенная выше схема противопоставляет включение канонической аминокислоты (АК) в белки и сайт-специфическое включение ncAA. Каноническое включение АК происходит после аминоацилирования, катализируемого эндогенной аминоацил-тРНК синтетазой, которая заряжает тРНК родственной аминокислотой. Аминоацилирование ncAA возможно посредством включения гетерологичной ортогональной (т.е. не перекрестно-реактивной с аппаратом клетки-хозяина) пары тРНК: синтетаза в клетку, ответственную за продукцию белка. Благодаря этому включению ортогональный ncAA может быть вставлен сайт-специфично в ответ на конкретный кодон (обычно стоп-кодон). Данный ncAA обычно имеет структуру, аналогичную канонической AA, за исключением того, что желаемый,атипичная химическая функциональная группа включена так, что она доступна для участия в реакции. Таким образом, после трансляции белок, включающий ncAA, легко модифицируется молекулами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ), который улучшает кровообращение и ограничивает немедленный почечный клиренс, или такой молекулой, как флуоресцентный зонд, который облегчает визуализацию, а также многими другими потенциальные возможности.

Возможные методы доставки лекарств

Методы белковой инженерии начали использоваться для разработки белков и пептидов, которые обеспечивают более эффективную и действенную доставку малых молекул, белков и нуклеиновых кислот через биологические барьеры и / или нацеленные на определенные ткани. Это очень важный момент, поскольку эффективная терапия сердечно-сосудистыми белками почти наверняка потребует адресной или локальной доставки к сердцу. Некоторые из этих стратегий уже упоминались или подразумевались, такие как функционализация терапевтического белка или микро- или наноносителя с нацеливающей последовательностью, полученной с помощью молекулярного дисплея или из сконструированного белкового каркаса. Эта общая концепция также применяется для обеспечения доставки генов с повышенной тканевой специфичностью 152. Кроме того,Dowdy и соавторы разработали концепцию слитых белков, содержащих домен трансдукции белка (PTD), для доставки белков 153. В этом методе интересующий белок сливается с PTD - иногда также называемым проникающим в клетки пептидом - например, полученным из белка ТАТ 153 вируса иммунодефицита человека. Это позволяет, среди прочего, белкам преодолевать биологические барьеры, которые обычно ограничивают их из-за соображений размера и заряда 154 (Рисунок 3). PTD также использовались для доставки генов 155. Концептуально подобный подход слитого белка, при котором интересующий белок сливается с антителом или пептидом, который транспортируется через биологический барьер, такой как гематоэнцефалический барьер,с помощью рецептор-опосредованного транспорта также был исследован 156 и иногда упоминается как подход «молекулярного троянского коня» 157. Некоторые из этих методов уже применялись для облегчения адресной доставки в миокард 158, и дальнейшее расширение этих и других усилий 159, вероятно, окажется критически важным для окончательного успеха сердечно-сосудистой терапии на основе белков.

Методы белковой инженерии, обеспечивающие доставку лекарств. Многочисленные методы в области белковой инженерии могут быть использованы для улучшения доставки небольших молекул, белков и нуклеиновых кислот к сердцу. Примеры, показанные выше, включают нацеливание наноносителя на интересующий тип клеток (например, кардиомиоциты, эндотелиальные клетки и т. Д.) С помощью молекулы пептида, полученной посредством молекулярного дисплея, и усиление клеточной интернализации терапевтического объекта посредством слияния с доменом трансдукции белка. (PTD).

Возможные технологии для клеточной терапии

Помимо предоставления альтернативы кардиологической терапии на основе клеток, белковая инженерия также может быть использована для расширения этого терапевтического подхода. Трансплантация сердечных клеток была ограничена плохой локализацией инъецированных клеток 160,

90% смертность клеток в течение одной недели после инъекции или имплантации 161, а в случае стволовых клеток - неконтролируемая пролиферация или дифференцировка клеток после трансплантации 162. Некоторые из этих ограничений были преодолены в последних клинических испытаниях 1, 2, однако эффективность и действенность клеточной кардиологической терапии все еще может быть улучшена. Наша группа применила терапевтический подход с использованием молекулярно сконструированных самособирающихся пептидных каркасов в сочетании с сконструированными белками для создания микросреды для улучшенного приживления и регенеративного потенциала трансплантированных клеток для регенерации миокарда 15, 49, 113. В этом случае самосборка происходит за счет электростатических взаимодействий между гетероспецифическими комплементарными аминокислотными последовательностями;пептидный каркас конструируется для экспрессии одной последовательности, а терапевтический белковый комплекс конструируется для экспрессии комплемента. Этот подход позволяет контролируемо отображать или доставлять почти любой выбранный фактор (-ы) роста вместе с клетками, которые могут связываться или иным образом взаимодействовать с пептидным каркасом. Таким образом можно улучшить дифференцировку и / или приживление трансплантированных клеток. Более того, исходные материалы легко синтезировать и очищать в больших масштабах. Этот и другие методы, позволяющие проводить клеточную терапию сердца, обеспечивают еще один терапевтический рубеж для инженерии сердечно-сосудистых белков.которые могут связываться или иным образом взаимодействовать с пептидным каркасом. Таким образом можно улучшить дифференцировку и / или приживление трансплантированных клеток. Более того, исходные материалы легко синтезировать и очищать в больших масштабах. Этот и другие методы, позволяющие проводить клеточную терапию сердца, обеспечивают еще один терапевтический рубеж для инженерии сердечно-сосудистых белков.которые могут связываться или иным образом взаимодействовать с пептидным каркасом. Таким образом можно улучшить дифференцировку и / или приживление трансплантированных клеток. Более того, исходные материалы легко синтезировать и очищать в больших масштабах. Этот и другие методы, позволяющие проводить клеточную терапию сердца, обеспечивают еще один терапевтический рубеж для инженерии сердечно-сосудистых белков.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Белковая инженерия - это мощный подход с неиспользованным потенциалом для развития сердечно-сосудистой терапии. Как указывалось ранее, около половины новых лекарств - это белки 4, и многие из этих терапевтических средств были созданы с помощью белковой инженерии. Применение этой технологии в терапевтических разработках должно только возрасти в будущем, и тем не менее, в настоящее время для лечения сердечно-сосудистых заболеваний в рутинной практике не используются разработанные белковые препараты, возможно, из-за недостатков в нашем нынешнем понимании молекулярных механизмов восстановления и регенерации сердца. который все еще развивается (авторы направляют читателя к нескольким обширным недавним обзорам по теме 163–166). С точки зрения терапевтического развития, два явления, которые способствуют восстановлению и регенерации миокарда, были в центре внимания большей части усилий:васкуляризация и кардиомиогенез. В то время как фундаментальные процессы, которые составляют васкуляризацию - ангиогенез, артериогенез и васкулогенез - относительно хорошо определены, механистические основы кардиомиогенеза остаются предметом споров. Будем надеяться, что достижения в области молекулярной кардиологии и разрешение фундаментальных противоречий внутри нее будут способствовать скачку вперед в сердечно-сосудистой медицине за счет более широкого использования инженерных белковых терапевтических средств.Достижения в области молекулярной кардиологии и разрешение фундаментальных противоречий внутри нее будут способствовать скачку вперед в сердечно-сосудистой медицине за счет более широкого использования инженерных белковых терапевтических средств.Достижения в области молекулярной кардиологии и разрешение фундаментальных противоречий внутри нее будут способствовать скачку вперед в сердечно-сосудистой медицине за счет более широкого использования инженерных белковых терапевтических средств.

Благодарности

Авторы приносят свои извинения тем, чьи работы не удалось процитировать из-за нехватки места.

Новости спорта

Изначально сайт создавался для пользователей со всех стран мира. Международный домен ориентирован на самых разных пользователей. Страницы сайта переведены на 46 языков, среди которых есть и азербайджанский. Это выгодно выделяет платформу на фоне конкурентов, так как многие из них либо не работают на территории данной страны, либо не имеют местной локализации.

Больше новостей